在激光的支持下，细胞疗法获得新突破！光穿孔细胞可保持其增殖能力，或还可杀死肿瘤细胞。

根特大学(Ghent University)的Kevin Braeckmans教授在过去的10年里专注于用光热纳米纤维安全工程治疗细胞的方法。我们从《Nature Nanotechnology》上可以了解这些生物相容的光热纳米纤维是如何开发的，以及在激光照射下，与这些纳米纤维亲密接触的细胞是如何被“穿透”的，并可以用各种效应分子转染，包括CRISPR/Cas9核糖核蛋白复合物和siRNA。

Braeckmans教授的团队证明，用这种纳米纤维转染的细胞——比如胚胎干细胞和人类T细胞，健康状况极佳，并可保持其治疗功能。

为细胞疗法奠定新基

细胞疗法（Cell-based therapies）是一种较新的治疗形式，通过向患者体内注射转基因细胞来预防或治疗疾病。一个众所周知的例子是癌症患者自身的免疫细胞，这些细胞可以在实验室环境中分离、遗传修饰和扩增，然后再次注入患者体内以攻击肿瘤细胞。

示意图 来源: DOI: 10.1038/s41565-021-00976-3

细胞的遗传修饰依赖于细胞内递送技术，这种技术通常效率不高，同时对细胞的健康和功能影响最小。在这方面，纳米粒子敏化光穿孔技术优势明显、应用前景，因为这种技术通常具备高效率、高通量和低毒性。该技术基于金纳米粒子(gold nanoparticles，G-NPs)等光响应纳米粒子的使用，比如金纳米粒子可以在脉冲激光照射下形成爆炸性纳米气泡，这些微小的爆炸可以在细胞膜上诱导小孔，让细胞介质中补充的外部效应分子进入细胞。

然而，纳米粒子敏化光技术向临床应用的转化受到细胞与(不可降解的)纳米粒子接触这一事实的阻碍，引起了毒理学和医疗监管相关方面的担忧。因此，需要一种新的方法来保持纳米粒子敏化光穿孔的优点，同时避免纳米粒子和细胞的直接接触。

Braeckmans教授和他的团队将光热氧化铁纳米粒子(iron-oxide nanoparticles,IONPs)嵌入到通过静电纺丝生产的生物相容性聚合物纳米纤维中。聚己内酯(Polycaprolacton,PCL)是一种生物相容性聚合物，广泛应用于生物医学领域，而离子聚合物具有成本效益，并且具有宽的光吸收光谱。

他们表明，在纳秒激光脉冲照射下，贴壁细胞和悬浮细胞都可以安全有效地转染一系列大分子。通过电感耦合等离子体-串联质谱(ICP-MS/MS)进行元素分析，他们证实了离子聚合物在激光照射后仍然安全地嵌入纳米纤维中，因此处理过的细胞有效地避免了直接暴露于纳米颗粒。为了更好地理解激光脉冲注量、离子液体分布和聚集状态如何影响细胞膜通透性，对从纤维嵌入的离子液体到附近细胞的热传递进行了数值模拟。

该团队通过实验证明，利用光热纳米纤维进行光穿孔可以成功地将包括siRNA或CRISP-Cas9核糖核蛋白(RNPs)在内的功能性生物分子递送至贴壁细胞和悬浮细胞，包括人胚胎干细胞(hESC)和原代人T细胞。用最先进的电穿孔进行了比较。尽管电穿孔细胞的表型和功能发生了变化，但光穿孔细胞却仍保持其增殖能力，而CAR-T细胞则还能杀死肿瘤细胞。

PEN光穿孔能有效地将大分子细胞内递送至胚胎干细胞

最后，用PEN光穿孔将siRNA（靶向受体PD1——一种众所周知的免疫检查点抑制剂）转染CAR-T细胞。证实siPD1处理的细胞在体内具有增强的肿瘤杀伤能力。

总之，它表明光热纳米纤维的光作用能够在多种细胞类型中高效、安全地在细胞内递送广泛的效应分子，而不接触潜在的有毒光热纳米颗粒。Braeckmans教授说：“我们认为，这是朝着利用光穿孔安全有效地生产基因修饰细胞疗法迈出的重要一步。”

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