文/Andrey Andreev

双光子显微成像是一种荧光成像技术，其应用日趋成熟。在双光子荧光显微成像装置中，最昂贵的设备是飞秒激光器，而大多数生物学家对此激光技术并不熟悉。双光子荧光显微成像中最常用是波长可调的钛蓝宝石（Ti：sapphire）激光器，其价格高达20万美元。好消息是，目前市场上已经有更便宜、更小巧的固定波长的光纤激光器，能够适用于双光子荧光成像。

钛蓝宝石激光器和光纤飞秒激光器用于成像的性能非常相似。^[1]目前，有十几家公司可以提供用于双光子显微成像的激光源。随着激光参数的增多，购买者往往很难做出决定。本文主要介绍钛蓝宝石激光器和光纤激光器的哪些参数对成像实验至关重要，从而帮助研究人员选择合适的激光器。

飞秒激光器与生物发现

有多种类型的显微成像实验有赖于飞秒激光器。本文重点关注利用双光子荧光成像技术和光遗传学技术对小鼠的深脑成像和对斑马鱼的全脑成像。荧光蛋白和光学门控离子通道的吸收光谱通常位于近红外波段，为900~1100nm。 波长较长的光波穿透能力强，散射低，其光波肉眼不可见，因此可以用于透明动物的光敏实验。单光子成像的光功率一般为微瓦量级，而双光子荧光需要的激光功率高达百毫瓦量级。并且激光能量越高，生物组织的双光子吸收效率就越高，因此需要使用短脉冲光源，如飞秒激光器。

在双光子荧光成像实验中，研究人员一般使用波长可调范围为700~1000 nm的钛蓝宝石激光器。钛蓝宝石激光器大约诞生于1986年，目前多家公司都能提供。根据激光器的不同波长，选择相应的荧光团，可以实现多色成像，也可以实现诸如新荧光团设计之类的光谱学应用。

目前在双光子显微成像中使用最多的光源就是钛蓝宝石激光器。 但是钛蓝宝石激光器本身具有很多不足之处，如单价高于12万美元、整个系统尺寸很大、重量重，以及与成像系统配合使用时无法灵活移动。此外，由于一般实验室平均每年的设备费预算只有10万美元左右，因此很少有实验室会购买钛蓝宝石激光器这样高价的设备。

单波长飞秒激光器是在2004年左右出现的一种新技术，其特点是只能输出固定波长的光。除了波长不能调谐外，其输出光的特性与钛蓝宝石激光器类似，并且激光器的体积更小，价格更便宜，起价约4万美元。单波长飞秒激光器由于体积小、运行方式更加节能，因此利用空气冷却取代了传统的水冷（如图1）。但是，目前关于这款激光器的使用经验还比较少，在运行稳定性和售后服务方面都存在不足。

图1：左右图分别为钛宝石超快激光器和其电源。其中蓝绿色激光器对应蓝绿色电源；橙色激光器对应橙色电源。从图中可见，波长固定的超快激光器（橙色）比波长可调的超快钛蓝宝石激光系统（蓝绿色）更加紧凑。因此，在双光子显微应用中，研究人员在选择激光器时必须考虑到每种激光器的优缺点。

表1：用于双光子成像的激光器选择

激光器参数的选择

双光子成像与激光器的多个参数有关（见表2）。第一个参数，也是最重要的一个参数是波长，常用的荧光蛋白如GFP和GCaMP，其激发波长为920~940nm，而红移荧光蛋白其激发波长为1040~1100 nm。

表2：荧光蛋白对应的双光子激发波长

此外，在双光子荧光成像和光遗传学应用中，还必须考虑激光功率，这是第二个参数。激光器制造商一直致力于提高激光功率输出，但在实际的成像实验中，可能并不需要如此高的功率。激光点扫描荧光成像技术需要波长为920nm、功率为10~100mW的激光，而激光层照荧光显微技术则可能需要500mW的功率。因此，即使考虑到50％损耗，所需的激光功率也不会超过1~2W。对于高功率激光器，可以将其光源分束，供两三台显微成像设备同时使用。波长可调的激光器在其可调波长范围内具有非恒定功率输出。例如，在920nm处输出功率为2W，而在1040nm处输出功率仅1W。

影响成像质量的第三个参数是激光的脉冲宽度，因为较短的脉冲可以更有效地产生荧光信号。^[2]用于成像的飞秒激光的脉冲宽度通常为80~200fs。影响成像质量的第四个重要参数是激光的重复频率，一般使用的重复频率为80MHz。在相同的平均功率下，较低的重复频率可以产生更有效的荧光激发。^[3]因此，较低的重复频率和较短的脉冲宽度使成像组织的光损伤较小，具体实例参照斑马鱼的实验。^[4]

在快速扫描成像中，仅使用几个脉冲即可生成单个图像像素（如共振扫描仪成像），因此需要激光器提供更高的单脉冲能量。平均功率和单脉冲能量的关系式如下：

平均功率 = 脉冲能量 × 重复频率

为实验选择合适的激光光源的难点在于，对于波长可调的激光器，其激光参数是相互关联的。波长越长，穿透就越深。然而，平均功率和脉冲宽度是波长的函数，因此无法使所有参数达到最优。固定波长激光器其参数出厂时就已经设定好，因此参数不可调。

激光器的选配模块

除了激光光源本身，激光系统通常还与其他选配模块一起使用。

有些公司将功率调节模块与激光器集成到一起，可以实时调节激光功率，这一点对双光子显微成像特别重要。但是，一些功率调节系统会产生高达25％的功率损耗，因此用户在选择的时候，要考虑到损耗的存在。目前，使用最普遍的普克尔盒（Pockels cell），能将功率损耗降到约2％~5％，成本约为1~1.5万美元，但是依然需要额外的电子控制系统配合其工作。

另一个比较有效选配模块是内置预补偿。由于色散，光脉冲在穿过光学元件时会产生脉冲展宽。初始脉冲宽度为60fs的脉冲激光通过显微镜的光学元件后，其脉宽会展宽到300fs，这就会使双光子的荧光信号降低50%。预补偿可以抵消色散效应。激光器内置了预补偿，通过计算机控制，可以对众多元件如物镜和反射镜等进行色散补偿。定制化的预补偿光学系统需要专业人员设计，例如使用一对啁啾镜可以实现色散补偿，其成本约为3000美元。

由于购买集成的预补偿和功率调节系统成本较高，有人可能认为用户自行采购元器件组装可以节省成本。但是，应该考虑到，集成系统的价格不只包括元器件本身的价格，还包括人工和时间成本、使用界面的友好性及产品的耐用性等。

对于钛蓝宝石激光器，其仅有的一个选配模块是双通道输出，可以同时实现700~1000nm可调波长输出和1040nm的固定波长输出。因此可以同时对激发波长不同的两种荧光蛋白如绿色荧光蛋白（GFP）和红色荧光蛋白（RFP）成像。如果选择固定波长的激光器做同样的实验，则需要两台激光器同时工作。钛蓝宝石激光器双通道输出选配模块中，固定波长输出通道没有色散预补偿，或者只有出厂设定的预补偿值。

如何购买激光器

用户在购买激光器时与销售的沟通可能不太顺畅。买家应向激光器专业销售详细咨询激光器的技术信息，包括激光光谱和脉冲形状（FROG测量）、其他配件的参数、冷却系统详细工作过程、功率大小、环境温度要求，以及是否需要安装不间断电源等。对于买家来说，最好与该公司近期内的买家取得联系，咨询购买激光器的注意事项。最后，要咨询激光器售后服务流程及费用。通常，激光器出现小问题时公司可以远程解决；但是在激光器出现重大故障时，要求激光器公司能够快速发出替代元件，确保激光器尽快恢复正常运行。

如果研究人员的应用非常明确，例如只对特定的荧光团和光遗传学分子成像，那么固定波长的激光器可能是不错的选择。 但是，如果要对多种荧光团激发成像，或者要为尚未深入研究的分子成像预留优化空间，那么钛蓝宝石波长可调的激光器将是合适的选择。

参考文献：

1. J. M. Bueno, J. Ávila, and P. Artal, Appl. Opt., 58, 3830–3835 (2019); https://doi.org/10.1364/ao.58.003830.

2. C. Xu and W. W. Webb, J. Opt. Soc. Am. B, 13, 481–491 (1996); https://doi.org/10.1364/josab.13.000481.

3. G. Donnert, C. Eggeling, and S. W. Hell, Nat. Methods, 4, 81–86 (2007); https://doi.org/10.1038/nmeth986.

4. V. Maioli et al., bioRxiv (Jun. 3, 2020); https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2020.06.02.130377v1.

5. J. B. Guild, C. Xu, and W. W. Webb, Appl. Opt., 36, 397–401 (1997); https://doi.org/10.1364/ao.36.000397.